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早就想写些实验操作方面的东西，可每次提笔又有些犹豫，想想大家多为业内人士，这次写出来算是交流吧。有什么意见、建议，大家可以尽情发言讨论，原则只有一点，尽快把自己的实验做好！

分步进行，引物设计及测序与测序结果分析请细心进行，不要贪快，只求精准，当然有时候引物是需要尝试才能确定的。

1. PCR扩增。一般引物会在上午送到，赶在午饭之前做上，可以省出午饭及午休时间，如果能更早一些做上当然更好。PCR反应一般1~3h不等，做的时候需要算好时间，提前把回收胶倒好，以便PCR结束即可使用。

2. 回收。上样加电泳一般30min即可，记住电泳前把金属浴或水浴锅打开，一般达到55~65度约需10min，未免遗忘早做准备。胶回收建议还是用试剂盒吧，至于如何挑选盒子我就不多说了，经济实惠的国产货绝对可以。回收一般25~30min。

3a. 可选操作。PCR产物有时可直接用来酶切，酶切一般0.5~2h即可，当然要考虑片段大小及酶切难易程度。本人曾切过最小70bp，连接效果OK。为测序方便及保险起见，连T几成常规。

3b. 连接，室温连30min~2h通常可满足要求。需根据片段大小比例考虑。现行的topo连接载体可缩短时间至几min，但事先一定要确定内切酶的问题。

4. 转化。常规操作，总体下来到涂板1.5h可以搞定。

5.划线及PCR鉴定、摇菌。根据菌株差异，7~12h可进行划线、菌P。菌株选择可根据时间选定。A）如果上午能做上转化，可选用克隆菌株JM109,Top10,Mach1 T1等，晚上8点~10点左右可划线、菌P，之后电泳检测，可选阳性摇菌。B）如果下午早些时候转化可用BL21，基本上也能赶上摇菌。C）再晚的话，建议转化Mach1 T1，XL1 Blue, 涂板后可等到次晨进行划线鉴定，鉴定后上午摇菌。此处各菌株属性及使用利弊请自行查阅。

6.提质粒，酶切鉴定。建议用试剂盒提吧。国产的花不了几个钱还能节省时间。如果不是做转染的话没必要花银子买更高级的。如果第5步采用A)或B）的话，次日上午提质粒，酶切鉴定（酶切用微波炉中火2min可行，常规酶切10~30min可行，一般常用内切酶各公司的使用效果无太大差异。切忌不要抱有越贵越好用的心理，我们是做科学的，当以科学的眼光评定）。如果第5步采用C）的话就等着晚上再提吧，当然这天上午你也不能闲着，下午到可以该干嘛干嘛^_^

7.送测序。这工作留给公司去做吧，自己做虽然能学点东西，但送公司的话可能更便宜，省出的时间可以干点别的。第5步采用A)或B）的可以赶在下午2点左右送样，这样的话或许能赶上当天那批安排测序，否则的话只好多等一天。采用C)的话就只好等到第三天叫测序了，相应的会再推迟一天。

时间总体统计我就不一一算了，课题说是老板的，但是实验是自己的，如何安排应该多思量。操作看上去简单，原理的把握一定要花些心思的，要不然我们干吗算是脑力劳动者呢？

以上是自己做载体方面的一些体会，个人看法，欢迎不同意见加入讨论。还有一句话要说的就是，老板们切忌以此例“过分严格的要求”学生，而应想办法让学生学会主动积极的去做；师者，传到授业解惑，倘一味苛求，何以称其为师？学生切忌以此例“寻规照搬”，其间有些细节此处未能尽讲，当熟谙原理及各时段安排，方可妥善应对。

一句话，不做则已，做就要有结果。套用BIOFUTURE用在《遗传》广告栏上的一句话“Do It Yourself, Your Future Is In Your Hand”

辛宇心愿：愿大家有所获，所谓交流即有收获；愿大家有所得，所得大于所见，所谓 意----犹未尽