转贴：TCR基因重排研究在肿瘤及白血病研究中的应用
wms 发表于 2007-11-20 17:18:00
正常T细胞未受任何刺激情况时，其TCR重排是随机的，其T细胞表现为多家族和多克隆性，具有发挥各种T细胞免疫作用的潜能。群体水平有极为丰富的多样性。当然，对于某个特定的个体，可能存在一定的TCRVβ的偏移现象，这种偏移现象随年龄的增加呈上升趋势，这可能是机体在长期适应环境的过程中，对某些特定的T细胞亚群的优先选择，或者是其受到某些未明抗原的持续刺激，导致了T细胞亚群的限制性表达。
在特殊的抗原刺激下，可引起某一个或几个亚家族的TCR 针对性和选择性重排，而出现TCR Vβ亚家族T细胞分布不均和克隆性增殖，这种现象已从多种肿瘤患者外周血T细胞中观察到，并已初步明确其性质，与肿瘤特异抗原或肿瘤相关抗原刺激所引起的T细胞特异性扩增有关。
一、肿瘤相关抗原特异性T细胞克隆的检测和分选
Puisieux最早报道了利用基因扫描分析黑色素瘤病人标本的研究，认为在肿瘤组织浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TIL）和外周血淋巴细胞（peripheral blood lymphocyte，PBL）中都存在有克隆性增殖的T细胞，在同一病人体内不论组织类型和病理分期，都表现为相同的克隆性T细胞，提示这些克隆性增殖的细胞是对肿瘤相关抗原的免疫反应。其它肿瘤如肾细胞癌、基底细胞癌、肝细胞癌和肺癌组织TIL或PBL中也发现克隆性增殖的T细胞。
在白血病患者研究中，由于白血病细胞循环于外周血中，与外周血T细胞密切接触，TCR基因的限制性利用情况更为显著。在B细胞肿瘤和不同类型髓性白血病外周血中均可发现TCR Vβ优势利用和克隆性增殖T细胞，在急性非淋巴细胞白血病中，TCRVβ的限制性利用最为明显，部分患者仅能检测到1个Vβ亚家族T细胞。利用灭活的白血病细胞或白血病相关抗原多肽等作为特异性抗原诱导正常人T细胞体外扩增，结果与白血病患者所表现的T细胞克隆性增殖情况相似，诱导增殖后的T细胞不再表达全部24个亚家族的TCR Vβ基因，而出现限制性表达某些Vβ亚家族，并出现1个或多个Vβ亚家族克隆性增殖T细胞。提示这些克隆性T细胞为抗白血病的T细胞。但由于个体差异性与肿瘤的异质性，这种选择性表达的TCR分布具有极高的个体特异性，即不同类型白血病、不同患者甚至同一患者患病的不同时期表达的优势TCR亚家族T细胞均不相同。各个患者表达优势TCR亚家族T细胞的数量也有多有寡，少者仅一个，多者达十多个。即使不同患者表达同一优势 TCR亚家族T细胞，也可能因存在该优势TCR亚家族内部不同亚型而出现个体差异，或者因其它结构的不同而出现不同的生物学特性和功能。
二、TCR基因重排研究在血液肿瘤治疗中的应用
对白血病患者外周血T细胞TCR Vβ亚家族优势利用及T细胞克隆性增殖的研究，不仅有助于我们了解白血病患者的细胞免疫状况，而且利于我们认识白血病细胞的抗原表达及其诱导抗原特异性T细胞的增殖规律，为白血病免疫治疗提供依据及方向。
1. 研制独特型TCR DNA疫苗
独特型TCR DNA疫苗的作用机制是通过其诱导患者体内产生抗独特性抗体和抗独特型CTL，激发机体自身的特异性免疫反应，作为靶向免疫治疗，达到清除MRD的目的。 根据TCR Vα或Vβ（多数采用Vβ）基因谱系分析肿瘤性T细胞特异的TCR基因重排序列，设计独特型TCR Vα或Vβ DNA疫苗（如嵌合型重组腺病毒疫苗），免疫小鼠后可以产生抗肿瘤的特异性免疫反应。相关研究报道了以质粒为载体的Vα Vβ Cβ-DNA疫苗能够在小鼠体内诱导抵御T细胞淋巴瘤的抗独特型免疫反应，这对于T细胞肿瘤的免疫治疗有很好的应用前景。
2. 白血病抗原多肽特异性CTL的克隆
基于肿瘤患者外周血或TIL出现克隆性增殖T细胞，并经体外试验证实其具有特异性抗肿瘤细胞毒性作用后，利用白血病抗原诱导自体或异体特异性CTL，应用于白血病患者的过继性细胞免疫治疗，清除微小残留病变，是目前白血病免疫治疗的一个目标。
已证实，利用白血病细胞体外混合淋巴细胞培养（mixed lymphocyte tumor culture，MLTC），可诱导自体和异体特异性的CTL反应。在白血病中，随着对白血病抗原了解的深入，已知白血病相关抗原主要有融合蛋白、白血病分化抗原、癌基因和抑癌基因的突变产物、白血病细胞超表达抗原等。实验证实，抗原与淋巴细胞结合过程中，只是其中的部分抗原决定族与淋巴细胞的HLA分子结合，因而，利用含有相应抗原决定族的多肽可替代整个蛋白抗原诱导特异性CTL，产生的CTL为单个亚家族的T细胞克隆。根据白血病细胞遗传学特点，可针对多种染色体易位形成的融合蛋白肽作为白血病特异的抗原，设计融合基因接头区域的融合蛋白多肽（bcr-abl、PML-RARα、AML1-MTG8等），直接刺激或通过DC提呈给T细胞，均有可能获得单一的克隆性CTL。
PML-RARα融合基因几乎表达于全部APL患者，体外利用PML-RARα融合蛋白多肽（21肽）已成功诱导出APL特异性CTL，对新鲜APL细胞具杀伤活性。在APL病人体内也发现有MHC限制性自体白血病细胞杀伤性T细胞存在。对自体和异体特异性CTL进行TCR Vβ以及基因扫描分析，找出克隆性增殖的淋巴细胞，并进一步通过杀伤性分析，确定对白血病细胞具有特异性杀伤活性的克隆性增殖性TCR VβT细胞，进而利用特异性的TCR Vβ单克隆抗体分离、扩增该克隆性增殖的T细胞，就可以获得足够数量的真正特异性的CTL克隆。在患者的大多数白血病细胞得到清除后过继性回输这些CTL，以发挥清除MRD的作用以及免疫监督功能，将为彻底根治APL带来希望。
在特殊的抗原刺激下，可引起某一个或几个亚家族的TCR 针对性和选择性重排，而出现TCR Vβ亚家族T细胞分布不均和克隆性增殖，这种现象已从多种肿瘤患者外周血T细胞中观察到，并已初步明确其性质，与肿瘤特异抗原或肿瘤相关抗原刺激所引起的T细胞特异性扩增有关。
一、肿瘤相关抗原特异性T细胞克隆的检测和分选
Puisieux最早报道了利用基因扫描分析黑色素瘤病人标本的研究，认为在肿瘤组织浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TIL）和外周血淋巴细胞（peripheral blood lymphocyte，PBL）中都存在有克隆性增殖的T细胞，在同一病人体内不论组织类型和病理分期，都表现为相同的克隆性T细胞，提示这些克隆性增殖的细胞是对肿瘤相关抗原的免疫反应。其它肿瘤如肾细胞癌、基底细胞癌、肝细胞癌和肺癌组织TIL或PBL中也发现克隆性增殖的T细胞。
在白血病患者研究中，由于白血病细胞循环于外周血中，与外周血T细胞密切接触，TCR基因的限制性利用情况更为显著。在B细胞肿瘤和不同类型髓性白血病外周血中均可发现TCR Vβ优势利用和克隆性增殖T细胞，在急性非淋巴细胞白血病中，TCRVβ的限制性利用最为明显，部分患者仅能检测到1个Vβ亚家族T细胞。利用灭活的白血病细胞或白血病相关抗原多肽等作为特异性抗原诱导正常人T细胞体外扩增，结果与白血病患者所表现的T细胞克隆性增殖情况相似，诱导增殖后的T细胞不再表达全部24个亚家族的TCR Vβ基因，而出现限制性表达某些Vβ亚家族，并出现1个或多个Vβ亚家族克隆性增殖T细胞。提示这些克隆性T细胞为抗白血病的T细胞。但由于个体差异性与肿瘤的异质性，这种选择性表达的TCR分布具有极高的个体特异性，即不同类型白血病、不同患者甚至同一患者患病的不同时期表达的优势TCR亚家族T细胞均不相同。各个患者表达优势TCR亚家族T细胞的数量也有多有寡，少者仅一个，多者达十多个。即使不同患者表达同一优势 TCR亚家族T细胞，也可能因存在该优势TCR亚家族内部不同亚型而出现个体差异，或者因其它结构的不同而出现不同的生物学特性和功能。
二、TCR基因重排研究在血液肿瘤治疗中的应用
对白血病患者外周血T细胞TCR Vβ亚家族优势利用及T细胞克隆性增殖的研究，不仅有助于我们了解白血病患者的细胞免疫状况，而且利于我们认识白血病细胞的抗原表达及其诱导抗原特异性T细胞的增殖规律，为白血病免疫治疗提供依据及方向。
1. 研制独特型TCR DNA疫苗
独特型TCR DNA疫苗的作用机制是通过其诱导患者体内产生抗独特性抗体和抗独特型CTL，激发机体自身的特异性免疫反应，作为靶向免疫治疗，达到清除MRD的目的。 根据TCR Vα或Vβ（多数采用Vβ）基因谱系分析肿瘤性T细胞特异的TCR基因重排序列，设计独特型TCR Vα或Vβ DNA疫苗（如嵌合型重组腺病毒疫苗），免疫小鼠后可以产生抗肿瘤的特异性免疫反应。相关研究报道了以质粒为载体的Vα Vβ Cβ-DNA疫苗能够在小鼠体内诱导抵御T细胞淋巴瘤的抗独特型免疫反应，这对于T细胞肿瘤的免疫治疗有很好的应用前景。
2. 白血病抗原多肽特异性CTL的克隆
基于肿瘤患者外周血或TIL出现克隆性增殖T细胞，并经体外试验证实其具有特异性抗肿瘤细胞毒性作用后，利用白血病抗原诱导自体或异体特异性CTL，应用于白血病患者的过继性细胞免疫治疗，清除微小残留病变，是目前白血病免疫治疗的一个目标。
已证实，利用白血病细胞体外混合淋巴细胞培养（mixed lymphocyte tumor culture，MLTC），可诱导自体和异体特异性的CTL反应。在白血病中，随着对白血病抗原了解的深入，已知白血病相关抗原主要有融合蛋白、白血病分化抗原、癌基因和抑癌基因的突变产物、白血病细胞超表达抗原等。实验证实，抗原与淋巴细胞结合过程中，只是其中的部分抗原决定族与淋巴细胞的HLA分子结合，因而，利用含有相应抗原决定族的多肽可替代整个蛋白抗原诱导特异性CTL，产生的CTL为单个亚家族的T细胞克隆。根据白血病细胞遗传学特点，可针对多种染色体易位形成的融合蛋白肽作为白血病特异的抗原，设计融合基因接头区域的融合蛋白多肽（bcr-abl、PML-RARα、AML1-MTG8等），直接刺激或通过DC提呈给T细胞，均有可能获得单一的克隆性CTL。
PML-RARα融合基因几乎表达于全部APL患者，体外利用PML-RARα融合蛋白多肽（21肽）已成功诱导出APL特异性CTL，对新鲜APL细胞具杀伤活性。在APL病人体内也发现有MHC限制性自体白血病细胞杀伤性T细胞存在。对自体和异体特异性CTL进行TCR Vβ以及基因扫描分析，找出克隆性增殖的淋巴细胞，并进一步通过杀伤性分析，确定对白血病细胞具有特异性杀伤活性的克隆性增殖性TCR VβT细胞，进而利用特异性的TCR Vβ单克隆抗体分离、扩增该克隆性增殖的T细胞，就可以获得足够数量的真正特异性的CTL克隆。在患者的大多数白血病细胞得到清除后过继性回输这些CTL，以发挥清除MRD的作用以及免疫监督功能，将为彻底根治APL带来希望。
